PRUEBA DE LA SACAROSA (PRÁCTICA XXV)

27/2/15

FUNDAMENTO
Consiste en situar los hematíes problema en un medio de baja fuerza ionica (ej: solución de sacarosa). Los hematíes tienden a fijar el complemento, por lo que los glóbulos rojos presentes en la muestra tienen una sensibilidad anormalmente alta al complemento tienden a sufrir la acción de liarse.

MATERIAL:

• 6 tubos de centrifuga.
• 3 cubetas de espectrofotómetro.
• Pipetas Pasteur.
• Pipetas graduadas (1 de 5 ml, 2 de 2 ml y 3 de 0.5ml)
• Una pipeta automática de 0.1 ml (100ul)
• Puntas de pipeta automática.
• Reloj.
• Centrifuga.
• Espectrofotómetro.
• Rotulador.
• Gradilla.
• Bata, guantes y papel de filtro.

REACTIVOS:

• Solución acuosa de sacarosa (azúcar común) a una concentración de 9.24%.
• Sangre control. Debe de ser extraída recientemente.
• Solución acuosa de amoniaco a una concentración de 0.04%.
• Suero fisiológico (0.9%)

MUESTRA:

• Sangre venosa anticoagulada (reciente).
• Sangre problema.

TÉCNICA:

1º .Rotulo 3 tubos. Uno con SF (suero fisiológico) , otro con SC (sangre control) y otro con SP (sangre problema).
2º. Relleno los tubos, de la siguiente forma:

                                Tubo SF                            Tubo SC                           Tubo SP
________________________________________________________________________________
Suero fisiológico
     (ml)                          1.8                              

Solución de sacarosa
        (ml)                                                               1.8                                  1.8

Sangre control
      (ml)                                                                 0.2

Sangre problema
      (ml)                          0.2                                                                         0.2


3º. Agitar, suavemente los tubos.
4º. Dejo los tubos en reposo, a temperatura ambiente por 30 minutos.
5º. Centrifugo a 2.000rpm por 5 minutos.

Nota=en el examen cojo dos muestras de sangre diferentes(una control y otra problema )







LECTURA DE RESULTADOS:
Puede ser visual o espectrofotométrica.
Visualmente cuando no se ve un botón sedimentario rojizo y un sobrenadante incoloro y trasparente no hay hemolisis. Pero si hay hemolisis se ve un liquido rojizo y trasparente. En los tubos SF y SC no tiene que haber hemolisis ya que estos funcionan como controles negativos.
Espectrofotometrica requiere la preparación de 3 tubos: tubo blanco (TB, tubo patrón (TPa) y tubo problema (TPr). Se prepara como en el siguiente cuadro:

                                              TB                      TPr                       TPa
______________________________________________________________________________
Solución de amoniaco
        (ml)                                 5                            5                         5

Suero fisiológico
       (ml)                                0.3            

Sobrenadante del
tubo SP (ml)                                                         0.3

Liquido resuspendido
del tubo SF (ml)                                                                               0.3

Después de preparar estos tubos, se recoge el liquido mantenido en cada uno de ellos y se mide su absorbancia en un espectrofotometro ajustado a 540nm.
El liquido del tubo blanco es el 0 de la absorbancia en el aparato y el liquido patrón se emplea para determinar la A que corresponde al 100% de hemolisis.
Los resultados de la prueba se ofrecen en forma de tanto por ciento de hemolisis, se calcula el porcentaje con esta formula:
                                     
                  %Hemólisis = A/AM   x   100

A= Absorbancia del liquido presente en el tubo problema.
AM= Absorbancia de liquido contenido en el tubo patrón (A máxima).
 A (TPr= 0,007) / AM(TPa = 0,438)  x  100 = 1,60 % de hemólisis
INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS:

La prueba de sacarosa es positiva en la HPM. Oscila entre el 10 y un 80% de hemolisis.
Y es negativa en la diseritropoyesis congénita tipo II (HEMPAS).

HOJA DE TRABAJO:
1º. ¿Con qué solución se hemolizan los hematíes vertidos en el tubo problema?

2º. ¿A qué concentración se prepara la solución de sacarosa?9,24 %

3º. ¿Cómo se llama también la sacarosa?azúcar común

4º.¿Qué es el ACD?ácido cítrico -dextrosa.

5º. ¿Cómo se prepara el tubo blanco?Amoniaco 5 ml y suero fisiológico 0,3 ml

6º. ¿Qué porcentaje de hemólisis suele producirse, con la prueba de la sacarosa, en la sangre de la HPN? Entre  10 y 80% de hemólisis.