PCR (13/05/15 )

FUNDAMENTO

Para ver que secuencia especifica de ADN tenemos cada uno o la "huella molecular del ADN"con un patrón de bandas que se obtiene con la PCR.
Este método es bueno para varias cosas :

• Para resolver asuntos de inmigración.
• En disputas de perros de pura raza y en casos de paternidad.
• En análisis forenses,los resultados se interpretan utilizando la estadística,la probabilidad y la genética de poblaciones.

PRIMERA PARTE  (Pizarra)

1º Células de la mucosa bucal ----3 ml de s.salina en tubo.

2º 1,4 ml a un eppendorf---centrifugo a 8000 r.p.m  x 5 minutos.

3º Decantar el sobrenadante con cuidado.

4º Añadimos 70 ul Matriz Instagene y resuspender.

5ºIncubar 10 minutos a 100 ºC -----enfriar a temperatura ambiente.

6º Centrifuga 13000 r.p.m  x 30 segundos.

7º Pasar 10 ul del sobrenadante a microtubo ------guardar al congelador.

MATERIAL

• Gradilla.
• Tubo de ensayo y tubo de hemólisis.
• Vaso de precipitados.
• Micropipeta de 50 ul y puntas de micropipeta.
• Centrifuga para eppendorf.
• Pipetas graduadas de 10 ml ,de5 ml y de 2ml.
• Cubeta de electroforesis y fuente de alimentación.
• Microondas. 
• Bata,guantes papel de filtro.
• Campana ultravioleta.

TÉCNICA :

1. Cojo un tubo de ensayo y le añado 3 ml de s.salino.
2. Cojo un bastoncillo  de algodón y me froto la mucosa bucal para obtener células y lo introduzco en el tubo de s. salino y lo mezclo.
3. Con una micropieta graduada paso 1,4 ml de la mezcla anterior a un eppendorf y lo centrifugo a 8000 r.p.m por  5 minutos.
4. Decantar (saco el sobrenadante con cuidado)y me quedo con el sobrenadante.
5. Le añado 70 ul de reactivo Instagen y mezclo con la punta de la micropipeta.
6. Incubo 10 minutos a 100 ºC y enfriamos a temperatura ambiente.
7. Centrifugo a 13000 r.p.m por 30 segundos.
8. Cojo 10 ul de sobrenadante y lo paso a otro eppendorf y lo rotulo con una inicial (para distinguirla el proximo día ) y se mete en el congelador.

SEGUNDA PARTE  (Pizarra )

• Tubo eppendorf con bolita: Ready to Go PCR + 18,5 ul de agua destilada +2 ul oligo 1 + 2 ul oligo 2 + 2,5 ul ADN (mezcla de ADNS ).
• Después un toque de voltex para que se mezclen .
• Y golpe de centrifuga (meter y sacar ) y seguimos con la PCR.

TÉCNICA

• Cojo un eppendorf y le añado 18,5 ul de agua destilada +2ul de oligo 1+2 ul de oligo 2(Nota =yo le he añadido 4 ul de oligo de mezclas de ADNS en vez del oligo 1 y del oligo 2 ) + 2,5 ul de la muestra de ADN de Rafa que tenia anteriormente en el congelador del día anterior y lo rotulo Rafa.

• Le he dado unos golpectitos con el dedo para mezclar y después con el vortex un golpe y luego en la centrifuga otro golpe (meter y sacar )y lo he metido al congelador para el siguiente día.

TERCERA PARTE

1. Necesito preparar un gel de agarosa:

Cojo un vidrio de reloj y peso 1,5 g de agarosa(bote tapón rosa),a continuación 10 ml de tampón TAE y lo echo en una probeta y enraso hasta 100 ml con agua destilada ,desues traspaso el líquido resultante a un vaso de precipitados y lo meto al microondas (lo meto y lo saco a menudo y le doy vueltas con ayuda de una varilla) hasta que se mezcle bien y nose vean hebras tiene que quedar como agua cristalina.

2.   Lo dejo enfriar un poco hasta unos 50ºC a temperatura ambiente y le añado  colorante Redsafe unos 5 ul ,remuevo con la varilla y la deposito después en una cubeta de electroforesis previamente sellada con cinta adhesiva,  le pongo los  peines  cuando ya está gel solidificado los retiro con cuidado y le retiro las cintas adhesivas y lo coloco sobre la cubeta grande de la electroforesis.

3 .Preparo un tampón de 1 x TAE :

En una probeta de 1000 ml ,le añado 100 ml de tampón TAE y 900 ml de agua destilada ,agito con la varilla . 

Este tampón  lo deposito en la cubeta de la electroforesis hasta la señal aproximadamente de máximo  ,queda cubierto el gel de agarosa.

4.Preparo un Tampón de carga con azul de metileno :

900 ul de glicerol + 25 mg de azul de metileno y enraso en la probeta hasta llegar 10 ml con agua destilada .

5. En el pocillo 1 se pone el tampón de carga de azul de metileno 10 ul y en 16 igual; en el pocillo 1 de la fila del medio se one 10 ul de tampón de comassie y en el 16 igual.

5.El tampón de carga comassie:(ya está preparado):
comassie + sacarosa + agua destilada.

6 .Saco del congelador mi muestra de ADN(Rafa ) y la dejo a temperatura ambiente ,mientras cojo 2 eppendorf ( a   y b)y le añado a uno 5 ul del  tampón de carga de azul de metileno+ 5 ul de ADN (a) y en el otro eppendorf 5ul del tampón de comassie + 5 ul de ADN (b) .
7.  Con la micropipeta cojo lo del eppendorf (a) y lo pongo el pocillo donde esta el cátodo negativo del extremo aproximadamente, en el pocillo nº 15 y el del (b) lo coloco en el pocillo 15 pero en la fila  del medio.

8. Se tapa la cubeta y se conecta los cables a la cubeta y a la fuente de alimentación de la electroforesis ,el cable negro para el polo negativo y el cable rojo al polo positivo( hacia donde migrará el ADN ).

9 . Se programa a 120 voltios por 30 minutos .

10 .Terminada la electroforesis se visualiza los fragmentos de ADN mediante luz ultravioleta y se hace una fotografia (con cuidado la luz ultravioleta puede dañar los ojos ).