PRUEBA CRUZADA MAYOR (22/05 /15)

FUNDAMENTO
Para antes de la donación,se coge suero del receptor con los hematíes del donante ,primero en medio salino y después en medio albuminoso y por último frente a suero antiglobulina de Coombs.Con este último detectaremos los anticuerpos que hayan quedado fijados a la membrana.
Es importante respetar los tiempos de incubación para evitar errores en la técnica.
MATERIAL

• Tubo de hemólisis .
• Centrifuga.
• Baño de agua.
• Pipetas Pasteur.
• Gradilla.
• Reloj.
• Bata,guantes,papel de filtro.

REACTIVOS

• Suero salino.
• Albumina bovina al 30 %.
• Suero antiglobulina de Coombs.

MUESTRA

• Suero del receptor (A2)
• Hematíes del donante (suspensión de hematíes al 5% del grupo A1).

TÉCNICA

1. En un tubo pongo 1 gota de suspensión de hematíes del donante y 2 gotas de suero receptor.
2. Mezclo y dejo a temperatura ambiente 2-3 minutos.
3. Centrifugo 1700 r.p.m por 1 minuto .
4. Leo el resultado, si  aglutina o no, cuando despego el botón de sedimento,si aglutina es incompatible y si no aglutina es compatible.
5. Añado albumina bovina al tubo 3 gotas y mezclo bien.
6. Incubo a 37º C durante 30 minutos.
7. Centrifugo a 1700 r.p.m por 1 minuto.
   
8. Leo el resultado en el medio albuminoso,no aglutina.
9. Lavo 3 veces los hematíes con solución salina para eliminar los anticuerposque no se han fijado a los eritrocitos.Retiro bien el sobrenadante del último lavado.
10. Añado al tubo 1 gota de Coombs.Mezclo bien .
11. Centrifugo a 1000 r.p.m por 2 minutos.
12. Y leo el resultado.

LECTURA DE LOS RESULTADOS

La lectura se realiza resuspendiendo el botón hemático con suavidad después de cada centrifugación se mira en el microscopio a 40 x si se observa reacciones débiles (yo lo he mirado con el visualizador y no ha aglutinado en ninguna de las fases ).

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS 

Si no aglutina en ninguno de los pasos indica que son compatibles y por lo tanto puede hacerse la transfusión de sangre.

La aglutinación en cualquiera de las fases indica incompatibilidad.

Si se observa hemolisis en cualquiera de los pasos es incompatible también.

HOJA DE TRABAJO

1. ¿Qué se enfrenta en la prueba cruzada mayor ? suero del receptor y hematíes del donante.
2. ¿Cuándo se debe realizar la prueba cruzada menor ?cuando se enfrenta el suero del donante con los hematíes del recetor.
3. ¿ Por qué  debemos realizar la prueba en medio salino y albumininoideo ? Para detectar todos los antígenos presentes.
4. ¿Qué pone de manifiesto el suero antiglobulina de Coombs ?Para detectar los anticuerpos que hayan quedados fijados a la membrana eritrocitaria.

RESULTADOS

RESULTADOS OBTENIDOS

• En el medio salino : no aglutina.
• En el medio albuminoso :no aglutina.
• En el suero antiglobulina :no aglutina.

VALORACIÓN DE LOS RESULTADOS

La sangre analizada es compatible.

DETERMINACIÓN RÁPIDA DE HEMOGLOBINA (21/05/15)

FUNDAMENTO

Para ver la concentración de hemoglobina  antes de una donación.
Los valores mínimos son .

• 12,5 g/dl en mujeres.
• 13,5 g/dl en los hombres.

MATERIAL

• Material de extracción de sangre capilar.
• Un vaso de precipitados de 50 ml.

REACTIVOS

• Solución de sulfato de cobre(17g de este en 100ml de agua destilada ),(solución madre ).
• Cojo 51 ml de la solución madre y le añado 49 de agua destilada.

MUESTRA

• Sangre capilar adecuadamente recogida o sangre de bolsa.

TÉCNICA

1. Cojo un vaso de precipitados y le echo 50 ml del reactivo de sulfato de cobre que ya tengo preparado.
2. Le dejo caer  una gota de sangre problema.
3. Y observo si se va al fondo o no.

LECTURA DE LOS RESULTADOS

Si la gota de sangre cae es porque es densa y si flota es menos densa que el sulfato de cobre. 

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Si la concentración de Hb es superior a 12 g/dl,la persona puede donar sangre,en casa contrario,la donación no puede ser realizada.

HOJA DE TRABAJO

1. ¿Cuál es el valor mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación ? 12,5g/dl .
2. ¿Con qué otra solución comparamos la densidad de la sangre ?con solución de sulfato de cobre a una densidad de 1,052g/dl

VALORACIÓN DE LOS RESULTADOS

El donante es apto

DETERMINACIÓN DE UN Du(20 /05/15)

FUNDAMENTO

El Du es un antígeno débil que no se manifiesta en las pruebas normales de determinación del Rh.Para ello cogemos hematíes problema con un suero que contiene anticuerpos D y después lo enfrentamos al suero de Coombs .Si hay antígeno Du en la superficie de los eritrocitos ,se produce la unión a los anticueros anti-D a sus receptores de membrana y en la segunda fase darán aglutinación en presencia del suero antiglobulina humana.Es una prueba de Coombs indirecta.

MATERIAL

• Tubo de centrifuga .
• Centrifuga.
• 3 Pipetas Pasteur.
• Vaso de precipitado.
• Gradilla.
• Reloj.
• Baño de agua.
• Bata,guantes y papel de filtro.

REACTIVOS

• Suero anti-D.
• Suero antiglogulina humana de conejo(suero de Coombs,frasco verde).
• Suero fisiológico.

MUESTRA

Suspensión de hematíes al 5 % del grupo O.

TÉCNICA 

• En un tubo de hemolisis pongo una gota de suero anti-D y una gota de suspensión de hematíes al 5 % del grupo O.
• Mezclo suavemente e incubo el tubo a 37ºC durante 30-45 minutos.
• Después lavo los hematíes con suero fisiológico tres veces seguidas a 1000 r.p.m. por 1 minuto.Quito el sobrenadante completamente después del último lavado.
• Le añado sobre el sedimento 1 gota de Coombs y mezclo.
• Centrifugo a 1000 r.p.m por 1 minuto.

LECTURA DE RESULTADOS

Observo si ha aglutinado despegando el coagulo con suaves golpecitos y lo observo sobre el visualizador.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

Si existe aglutinación ,el resultado es positivo.Indica que en la membrana de los hematíes hay antígeno Du,y se clasifica la sangre como Rh ositivo variante Du.

Si no aglutina se clasifica la sangre como Rh negativo.

Para evitar falsos positivos ,debemos realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes problema.Eso nos servirá como control negativo.

HOJA DE TRABAJO

1. ¿Qué contiene el suero de Coombs ?suero antiglobulina humana de conejo.
2. ¿Qué se detecta con la prueba directa ?un falso positivo.
3. ¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta?un Rh + Du (débil).
4. ¿Qué buscamos en la sangre del paciente ?antígeno Du.
5. ¿Qué ocurre si el control es positivo ? que la membrana de los hematíes del aciente hay antígeno Du.

RESULTADO OBTENIDO

NO AGLUTINA,POR LO TANTO LA SANGRE ES Rh NEGATIVO

PCR (13/05/15 )

FUNDAMENTO

Para ver que secuencia especifica de ADN tenemos cada uno o la "huella molecular del ADN"con un patrón de bandas que se obtiene con la PCR.
Este método es bueno para varias cosas :

• Para resolver asuntos de inmigración.
• En disputas de perros de pura raza y en casos de paternidad.
• En análisis forenses,los resultados se interpretan utilizando la estadística,la probabilidad y la genética de poblaciones.

PRIMERA PARTE  (Pizarra)

1º Células de la mucosa bucal ----3 ml de s.salina en tubo.

2º 1,4 ml a un eppendorf---centrifugo a 8000 r.p.m  x 5 minutos.

3º Decantar el sobrenadante con cuidado.

4º Añadimos 70 ul Matriz Instagene y resuspender.

5ºIncubar 10 minutos a 100 ºC -----enfriar a temperatura ambiente.

6º Centrifuga 13000 r.p.m  x 30 segundos.

7º Pasar 10 ul del sobrenadante a microtubo ------guardar al congelador.

MATERIAL

• Gradilla.
• Tubo de ensayo y tubo de hemólisis.
• Vaso de precipitados.
• Micropipeta de 50 ul y puntas de micropipeta.
• Centrifuga para eppendorf.
• Pipetas graduadas de 10 ml ,de5 ml y de 2ml.
• Cubeta de electroforesis y fuente de alimentación.
• Microondas. 
• Bata,guantes papel de filtro.
• Campana ultravioleta.

TÉCNICA :

1. Cojo un tubo de ensayo y le añado 3 ml de s.salino.
2. Cojo un bastoncillo  de algodón y me froto la mucosa bucal para obtener células y lo introduzco en el tubo de s. salino y lo mezclo.
3. Con una micropieta graduada paso 1,4 ml de la mezcla anterior a un eppendorf y lo centrifugo a 8000 r.p.m por  5 minutos.
4. Decantar (saco el sobrenadante con cuidado)y me quedo con el sobrenadante.
5. Le añado 70 ul de reactivo Instagen y mezclo con la punta de la micropipeta.
6. Incubo 10 minutos a 100 ºC y enfriamos a temperatura ambiente.
7. Centrifugo a 13000 r.p.m por 30 segundos.
8. Cojo 10 ul de sobrenadante y lo paso a otro eppendorf y lo rotulo con una inicial (para distinguirla el proximo día ) y se mete en el congelador.

SEGUNDA PARTE  (Pizarra )

• Tubo eppendorf con bolita: Ready to Go PCR + 18,5 ul de agua destilada +2 ul oligo 1 + 2 ul oligo 2 + 2,5 ul ADN (mezcla de ADNS ).
• Después un toque de voltex para que se mezclen .
• Y golpe de centrifuga (meter y sacar ) y seguimos con la PCR.

TÉCNICA

• Cojo un eppendorf y le añado 18,5 ul de agua destilada +2ul de oligo 1+2 ul de oligo 2(Nota =yo le he añadido 4 ul de oligo de mezclas de ADNS en vez del oligo 1 y del oligo 2 ) + 2,5 ul de la muestra de ADN de Rafa que tenia anteriormente en el congelador del día anterior y lo rotulo Rafa.

• Le he dado unos golpectitos con el dedo para mezclar y después con el vortex un golpe y luego en la centrifuga otro golpe (meter y sacar )y lo he metido al congelador para el siguiente día.

TERCERA PARTE

1. Necesito preparar un gel de agarosa:

Cojo un vidrio de reloj y peso 1,5 g de agarosa(bote tapón rosa),a continuación 10 ml de tampón TAE y lo echo en una probeta y enraso hasta 100 ml con agua destilada ,desues traspaso el líquido resultante a un vaso de precipitados y lo meto al microondas (lo meto y lo saco a menudo y le doy vueltas con ayuda de una varilla) hasta que se mezcle bien y nose vean hebras tiene que quedar como agua cristalina.

2.   Lo dejo enfriar un poco hasta unos 50ºC a temperatura ambiente y le añado  colorante Redsafe unos 5 ul ,remuevo con la varilla y la deposito después en una cubeta de electroforesis previamente sellada con cinta adhesiva,  le pongo los  peines  cuando ya está gel solidificado los retiro con cuidado y le retiro las cintas adhesivas y lo coloco sobre la cubeta grande de la electroforesis.

3 .Preparo un tampón de 1 x TAE :

En una probeta de 1000 ml ,le añado 100 ml de tampón TAE y 900 ml de agua destilada ,agito con la varilla . 

Este tampón  lo deposito en la cubeta de la electroforesis hasta la señal aproximadamente de máximo  ,queda cubierto el gel de agarosa.

4.Preparo un Tampón de carga con azul de metileno :

900 ul de glicerol + 25 mg de azul de metileno y enraso en la probeta hasta llegar 10 ml con agua destilada .

5. En el pocillo 1 se pone el tampón de carga de azul de metileno 10 ul y en 16 igual; en el pocillo 1 de la fila del medio se one 10 ul de tampón de comassie y en el 16 igual.

5.El tampón de carga comassie:(ya está preparado):
comassie + sacarosa + agua destilada.

6 .Saco del congelador mi muestra de ADN(Rafa ) y la dejo a temperatura ambiente ,mientras cojo 2 eppendorf ( a   y b)y le añado a uno 5 ul del  tampón de carga de azul de metileno+ 5 ul de ADN (a) y en el otro eppendorf 5ul del tampón de comassie + 5 ul de ADN (b) .
7.  Con la micropipeta cojo lo del eppendorf (a) y lo pongo el pocillo donde esta el cátodo negativo del extremo aproximadamente, en el pocillo nº 15 y el del (b) lo coloco en el pocillo 15 pero en la fila  del medio.

8. Se tapa la cubeta y se conecta los cables a la cubeta y a la fuente de alimentación de la electroforesis ,el cable negro para el polo negativo y el cable rojo al polo positivo( hacia donde migrará el ADN ).

9 . Se programa a 120 voltios por 30 minutos .

10 .Terminada la electroforesis se visualiza los fragmentos de ADN mediante luz ultravioleta y se hace una fotografia (con cuidado la luz ultravioleta puede dañar los ojos ).

GRÁFICAS DEL Rh 7 /5 /15

GRÁFICAS DEL GRUPO SANGUÍNEO 13 /05 /15

DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Y GENOTIPO DEL SISTEMA Rh 7/5/15

FUNDAMENTO

Para investigar el genotipo del sistema Rh enfrento los hematíes problema a distintos antisueros dirigidos contra los antígenos que componen el RH.Si hay se aglutinan .

MATERIAL

• Tubos de hemolisis.
• Centrifuga.
• Rotulador.
• Pipetas Pasteur desechables.
• Gradilla.

REACTIVOS

• Suero anti-D
• Suero anti-E
• Suero anti-C
• Suero anti-e
• Suero anti-c

MUESTRA

Suspensión de hematíes lavados ,al 5 % en suero fisiológico.

TÉCNICA

• Primero preparo el lavado de hematíes (que ya lo tengo preparado ).
• Rotulo 5 tubos ,cada uno con una letra D,C,E,c y e.
• A cada tubo le añado una gota del antisuero correspondiente y una gota de la suspensión de hematíes .Homogeinizo suavemente.
• Centrifugo a 1000 r.p.m por 1 minuto.

LECTURA DE LOS RESULTADOS

Golpeo suavemente  los tubos con el dedo medio el fondo del sedimento para despegar el coagulo y los observo en el visualizador.

Si hay aglutinación es positivo y se puede apreciar grumos rojos sobre un líquido claro.

La ausencia de aglutinación es un resultado negativo y se ve la suspensión homogénea rojiza.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS

Un resultado positivo indica la presencia del antígeno del sistema Rh buscado en ese tipo.El resultado negativo indica lo contrario.

Los cinco resultados obtenidos expresan el fenotipo de la sangre analizada y se comparan con los contenidos en la tabla de fenotipos y genotipos del sistema Rh.

Si la sangre analizada es Rh negativa (D-),se puede determinar su único genotipo posible con respecto al sistema Rh.Pero ,si la sangre es Rh + ( D +) ,existen varios genotipos posibles que dan lugar al fenotipo previamente detectado.

HOJA DE TRABAJO 

1. ¿Qué antisueros se utilizan en está técnica ?Antisueros D,E,C,e y c.
2. ¿Por qué no existe suero anti-d? Por que no hay antígeno d.
3. ¿Qué expresan los cinco resultados obtenidos ? El fenotipo de la sangre analizada.
4. Si la sangre es Rh +,¿puede determinarse exactamente su genotipo con respecto al sistema Rh ?No, porque existen varios genotipos posibles.
5. Si los resultados obtenidos son : D-, C- , E+ ,c+ y e- ; ¿cuál es el genotipo posible de esta sangre ? dcE/dce ( según Fisher-Racer ).

RESULTADOS OBTENIDOS 

TUBO                                AGLUTINACIÓN

     D                                          -                 

     C                                          +                

     E                                           +               

     c                                            +                

     e                                            +                

VALORACIÓN DE LOS RESULTADOS

El/los genotipo/s posible/s del sistema Rh en la sangre analizada es /son : dCe/dcE     dCE/dce (según Fisher-Race )

Según Wiener = ( r Y)