ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA (29 /1 /15 )

MATERIAL :

• Tiras de cellogel 2,5 x 17 cm
• Aplicador de electroforesis semimicro.
• Rodillo.
• 6 bandejas.
• Fuente de alimentación /cubeta /puente.
• Placa de vidrio.
• Tubo de centrifuga de cristal cónico graduado.
• Gradilla.
• Pipeta Pasteur.                                                                             
• 3 vasos de precipitados.
• Pipeta graduada de 5ml.
• Micropipeta(0,5 ml punta azul )

REACTIVOS :

• Suero fisiologico.
• Agua destilada.
• Solución decolorante:Solución Acido Acetico 5%.
• Solución transparentadota de electroforesis (metanol,ciclohexanona,ac.acetico glacial ).
• Una vez que mezclamos la solución A y B caduca a los 15 días.
• Cloroformo (Triclorometano).
• Metanol.
• Tampon o buffer Tris-hippurate .Cod 02c11-12. PH 8,8. cellogel.
• Colorante:Negro amido.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: (Hemolizado).

-Cojo sangre de la bolsa y  echo 3 ml en el tubo de cristal cónico graduado.

-Centrifugo a 3000 r.p.m./ 10 minutos.A continuación quito el sobrenadante.

-Cojo la pipeta graduada  5ml de suero salino y se lo añado al tubo ,homogeinizo y vuelvo a centrifugar 3000rpm/10 minutos.

-Lavo 3 veces más.

-En el último lavado,retiro el sobrenadante y me quedo con 1 ml de sangre sedimentada y le añado+1,5 de agua destilada + 0,5 ml de cloroformo (miropipeta punta azul o con la de plástico ).

-Agito la mezcla en el agitador de tubos vibratorio.

-Centrifugo 3000 r.p.m./20 minutos.

-Cojo el sobrenadante que es la muestra con la que voy a trabajar.

ELECTROFORESIS :

• Saco las tiras Cellogel(del frigorífico)con las pinzas y la coloco sobre la cubeta que lleva los electrodos que ya le he echado tampón :Tris -Glicocola 10' .
• Pongo la tira cortada mirando hacia a mi lado derecho y la seco con papel de filtro  y la coloco sobre el puente y por sus ranuras,mirando el lado cortado hacia el cátodo (-).
• Las tiras tienen que estar sumergidas en el tampón ,le hago una marca con el lapiz en el lado de la tira que esta mirando hacia el cátodo y a continuación con la ayuda de un capilar marco una linea paralela a la que he marcado con el lápiz con la muestra de sobrenadante.
• Tapo la bandeja y conecto los electrodos a la fuente de alimentación (400 voltios /15 ' ).
• Saco la tira y la pongo boca abajo (punta cortada hacia la izquierda )en el colorante negro Amido por 10 ' y sobre un agitador de bandeja .

• Saco la tira con las pinzas y la paso a la cubeta que tengo Ácido acético al 5 % por 10 ' por tres lavados .
• Paso a la cubeta con metanol(deshidrato ) pongo la tira y la dejo 1' .
• Después paso la tira a la cubeta de solución trasparentadora :Clearing Solutión unos 2-3 '
• Ahora paso la tira sobre una placa de vidrio con la cara absorbente hacia abajo  y con la ayuda de un rodillo aliso la tira.
• La meto en la estufa (60-70 ºC)hasta que la tira quede trasparente (5-6 ').
• Dejar enfriar la placa,a temperatura ambiente durante unos minutos .
• Desprender las tiras.

LECTURA DE LOS RESULTADOS :

Puede apreciarse visualmente la banda anómala o alteraciones (ausencia o adelgazamiento o ensanchamiento) en las bandas anormales.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS :

Con la electroforesis se permite detectar anomalías cuantitativas o cualitativas .

-Cuantitativa :se deben al aumento o disminución de una hemoglobina con respecto al resto.Por ejemplo : Beta-talasemia.

-Cualitativa de la hemoglobina (hemoglobinosis ) aparecen unas bandas anormales .Por ejemplo :anemia falciforme.

HOJA DE TRABAJO :

1º¿De qué material son las tiras empleadas en está técnica ?

-Cellogel.

2º¿Cuál es el decolorante del Rojo Ponceau ?-Solución acuosa:äcido acético 5 %.

3º¿Cómo se llama el aparato que lee las bandas de las tiras y las transforma en curvas de área mensurable ?

-Fotodensitómetro.

4º ¿En qué enfermedad aparece una banda electroforetica de Hb S ?

Anemia falciforme homocigótica.

5º ¿Cuál es la Hb normal más electro negativamente ?

-Hemoglobina A.