FUNDAMENTO :
Para verla resistencia de los hematíes en soluciones de presión osmótica decreciente,en condiciones constantes de pH y temperatura.y se hace enfrentando los hematíes problema a soluciones taponadas de cloruro sódico(soluciones hipotónicas ).
Cuando los eritrocitos están en contacto con las soluciones hipotónicas,penetra agua a través de su membrana y se hinchan,al hincharse ,una parte de la Hb que contiene puede salirse a través de los poros de su membrana.Si entra demasiado liquido los hematíes se rompeny deja libre toda la Hb que contienen(hemólisis ).
Un hematíe puede estar sin hemolizarse con una entrada de agua que no supere el volumen del 70% como máximo.
Está prueba sirve para ver la capacidad que tienen los glóbulos rojos para soportar un incremento de su contenido acuoso(resistencia osmótica eritrocitaria o ROE).
En una misma sangre ,la ROE de los hematíes varia de unos a otros.
MATERIAL :
- 2 pipetas Pasteur.
- 9 tubos de centrifuga iguales.
- Un reloj.
- Una centrífuga.
- Un espectrofotómetro.
- Cubetas de espectrofotómetro.
- Una gradilla.
- Rotulador.
- 3 vasos de precipitados ,un grande y dos pequeño.
- Bata ,guantes y papel de filtro.
REACTIVOS :
- Suero fisiológico tamponado a pH (7,4).
- Agua destilada.
MUESTRA:
- Sangre venosa anticoagulada con heparina (fresca).
Nota :he utilizado sangre de bolsa .
TÉCNICA :
- Cojo 8 tubos de centrifuga por que en la centrifuga no cogen más y los rotulo salteados 1,3,5,8,10,14,16 y 18 los pongo sobre la gradilla,ya que la batería de soluciones es hasta 18.
- Cuadro con las cantidades que hay que poner en cada tubo:
____________________________________________________________
Agua destilada
(gotas ) 0 2 4 7 9 13 15 17
Suero fisiológico
tamponado(gotas ) 18 16 14 12 9 5 3 1
Concentración
obtenida (g/l) 9 8 7 5,5 4,5 2,5 1,5 0,5
- Una gota de sangre a cada tubo.,sin que toque la pared interna del tubo.
- Agito suavemente los tubos.
- Dejo los tubos en reposo a temperatura ambiente unos 30 minutos.
- Centrifugo los tubos a 2000 r.p.m por 5 minutos .También se pueden dejar 3 horas en reposo en vez de centrifugar.
- Saco el sobrenadante del tubo 1 y lo pongo sobre la cubeta del espectrofotómetro y anoto la medida que me da y así sucesivamente con los demás tubos.
Nota : se coge las la cubeta por el lado esmerilado y echo el sobrenadante por las paredes para que no se produzcan burbujas y si me salen se las quito antes de meterlas en la máquina.
LECTURA:
- La lectura puede ser visual o espectrofotométricamente,se valora la presencia de hemólisis en los tubos.
- Si es visual : se considera que no hay hemólisis cuando se ve un sedimento en forma de botón rojizo y un líquido sobrenadante incoloro y trasparente.Pero una hemólisis parcial sería cuando aparece el boton y el sobrenadante es rojizo y transparente .Y hemólisis total cuando sólo se ve un liquido de rojizo y tranparente.
- Con el espectrofotómetro : se recoge de forma separada el sobrenadante de cada tubo y se mide su absorbancia(A), a una longitud de onda de de 540 nm.
- El blanco será el del tubo nº 1,por ser una concentración al 9 g /l y la hemolisis es nula y por lo tanto su absorbancia no ha ser valorada.
- Los resultados de cada tubo se pone en forma de porcentaje (%) .Siendo la A del tubo 18 la que tiene un 100% de hemólisis ya que ha sido preparado con la solución más hipotónica.Y por lo tanto se calcula con la siguiente fórmula :
A=Absorbancia del líquido presente en el tubo analizado.
AM =Absorbancia del líquido contenido en el tubo nº 18(A máxima ).
% de hemólisis = A /AM x 100
INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS :
En condiciones normales se puede ver visualmente una hemólis parcial a partir del tubo 10u 11 del 50 % de hemólisis y total a partir del tubo 12,13 ó 14.
Cuando la ROE baja,aumenta la hemólisis en los tubos que contiene mayor concentación salina.Esto sucede en :la esferocitosis hereditaria,en la eliptocitosis u ovalicitosis congénita y en la estomatocitos hereditaria,estos toleran peor la entrada de agua y tienen aumentada su fragilidad osmótica.
Cuando la ROE sube , se retarda la hemólisis y empieza en los tubos que tienen una concentración salina menor .Esto sucede en la talasemis minor y en la anemia ferropénica,estas células toleran mejor la entrada de agua y tienen disminuida su gragilidad osmótica.
HOJA DE TRABAJO :
1º¿Qué concentración de Na Cl tiene el suero fisiológico ?Está tamponado a pH (7,4).
2º¿En qué porcentaje se puede incrementar normalmente el volumen de los hematíes sin qué estos se rompan ?en una concentración de g/l :9 , 8,5 , 8 , 7,5 ,7 ,6,5 , 6 ,5,5 y 5 .
3º¿Qué sustancia se emplea para anticoagular la sangre en esta prueba ? cloruro sódico .
4ºEn esta prueba,¿cuál es la concentración salina menor a la qué se preparan las soluciones ? 9 .
5º En condiciones normales,¿a qué concentración salina suele producirse una hemólisis del 50 % ? a 4,5 y 4 g/l.
6º ¿En qué enfermedades se produce una disminución de la ROE ?esferocitosis hereditaria ,eliptocitosis u uvalocitosis cóngenita y en la estomacitosis hereditaria
.
RESULTADOS OBTENIDOS :
Lectura visual :
- Primer tubo en el que se observa con claridad una hemólisis parcial : el 10.
Concentración de la solución salina contenida en este tubo : 4,5.
- Primer tubo en el que se aprecia una hemólisis prácticamente total :el 18.
Concentración de la solución salina presente en este tubo : 0,5
LECTURA ESPECTROFOTOMÉTRICA :
Tubo nº A %
___________________________________
3 0.651 67.70
5 0.774 73.36
8 0.958 90.80
10 1.008 95.54
14 1.080 102.36
16 0.978 92.70
18 1.055 100
- Concentración de la solución salina que da lugar a una hemólisis del 50%: 4.5
- La fragilidad osmótica de los hematíes en la sangre estudiada es: Alta (cuando es antes del tubo 10 es fragil)
- La ROE de la sangre analizada es: Baja.
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